ClinGen APC基因-ACMG/AMP变异分类标准的应用使得VUS变异大幅降低

       家族性腺瘤性息肉病(Familial adenomatous polyposis , FAP)是一种常染色体显性遗传疾病，也是最常见的单基因胃肠道息肉病。APC基因致病性变异是导致家族性腺瘤性息肉病的常见原因，高达85%的腺瘤性息肉病患者可发现APC基因的致病变异，其中大多数是功能丧失变异(Loss of function, LoF)。随着多基因panel、全外显子组等基因组测序技术的广泛应用，在无息肉病相关表型的个体中检出了大量APC基因的临床意义不确定(Varients of Uncertain Significance, VUS)的变异，这些VUS变异给临床诊断带来了不确定性和一定的挑战。

       随着ACMG/AMP指南的不断发展，ClinGen变异解读专家组(Variant Curation Expert Panels, VCEPs)对变异评估方法和证据使用进行了完善，并制定了针对特定基因或疾病的ACMG/AMP分类标准。国际胃肠道遗传性肿瘤学会(International Society for Gastrointestinal Hereditary tumors, InSiGHT)负责管理的莱顿开放变异数据库(Leiden Open Variation Database，LOVD)是全球最大的胃肠道癌易感基因变异数据库。最近几年，ClinGen-InSiGHT遗传性结直肠癌/息肉病变异解读专家组(HCCP VCEP)成立，APC基因专家小组(APC  VCEP)制定了APC基因-ACMG/AMP变异分类标准。本研究中，根据APC基因-ACMG/AMP变异分类标准，使用相应的算法，对ClinVar和LOVD数据库中所有APC基因变异进行分类，以期得到最准确的致病性评级。

图1.输入网址https://www.lovd.nl/，进入LOVD数据库，可以对胃肠道癌相关基因和变异进行查找

研究方法

一、将19个APC基因变异数据库数据进行归纳整理，合并成APC基因LOVD数据库；

二、选择GenBank NM_000038.6,25转录本，将整理好的APC基因变异按照人类基因组变异学会(Human Genome Variation Society，HGVS)指南进行标准化命名，使用Ensembl Variant Effect Predictor(VEP)软件对非结构变异进行注释，使用Mutalyzer软件对大于50bp的结构变异进行人工注释；

三、根据APC基因-ACMG/AMP变异分类标准(https://cspec.genome.network/cspec/ui/svi/doc/GN089)设计了包含所有证据的算法流程，系统性的评估了数据库中的所有APC基因变异。

APC基因-ACMG/AMP变异分类标准简介

1、致病性证据

·PVS1：功能丧失变异根据PVS1决策树进行升降级；

·PS1、PM5：可用于错义变异和剪接变异；

·PS3：主要为RNA和蛋白水平实验；

·PM2_Supporting：gonAD数据库等位基因数量>1时，人群频率≤0.0003%，gonAD数据库等位基因数量≤1时，人群频率＜0.001%；

·PP3：只进行剪接预测，不进行保守性和进化性预测；

·PS2、PS4、PM6、PP1：根据患者表型特异性和病例数进行累加计分。

图2-1.APC基因-ACMG/AMP变异分类标准简介（致病性证据）

2、良性证据

·BA1：人群频率≥0.1%；

·BS1：人群频率≥0.001%；

·BP1：除β-连环蛋白结合域15-氨基酸重复区域（氨基酸范围：1021-1035）之外的所有错义变异；

·BP7：预测不影响剪接的同义变异和内含子变异（位于或超过+7/-21）。

图2-1.APC基因-ACMG/AMP变异分类标准简介（良性证据）

3、不适用于APC基因的证据：PM1、PM3、PM4、PP2、PP4、PP5、BP3、BP6。

变异分类算法流程

人群频率过滤→预测软件使用→功能实验查找→临床数据查找→同一氨基酸位置证据使用

图3.变异分类算法流程图

研究结果

1、重新评估结果

       本研究共分析了10228个APC基因变异，其中包括190个（2%）结构变异和10038个（98%）非结构变异体。ClinVar和LOVD数据库分别收录9121和1887个APC基因变异。 

       使用APC基因-ACMG/AMP变异分类标准前：ClinVar数据库中数量最多的是VUS变异（67%），其次是B/LB（20%）和P/LP变异（14%）；LOVD数据库中数量最多的是P/LP变异(76%)，VUS变异仅占16%，B/LB变异占8%。

       使用APC基因-ACMG/AMP变异分类标准后：ClinVar数据库中数量最多的是B/LB变异（46%），其次是VUS变异（41%）和P/LP变异（13%）；LOVD数据库中数量最多的是P/LP变异（75%），其次是B/LB变异（16%）和VUS变异（10%）。

       总体来看，VUS变异的数量从6,142个显著减少到3,866个（p < 0.05）,VUS变异数量大幅下降。

图4.使用APC基因-ACMG/AMP变异分类标准前后，APC基因变异致病性分类图

2、最常使用证据

       对于致病性变异，PM2_Supporting证据和PVS1_Variable证据使用最多。其中，PM2降级为PM2_Supporting，是致病性变异降级为可能致病性变异的主要原因。

       对于良性变异，BA1证据使用最多，对于可能良性变异，BS1证据、BP4证据、BP7证据使用最多。其中，BS1证据的使用（等位基因频率阈值的改变），使得VUS变异降级为LB/B变异的影响最大，BP4和BP7证据的使用，对于不具有剪接效应的内含子变异和同义变异从VUS变异降级为LB/B变异有显著影响(P < 0.05)。

表1.APC基因-ACMG/AMP变异分类导致非VUS变异最常使用证据结果表

3、进一步评估

       根据人群频率、文献报道相关信息，对37个变异进行进一步评估，结果如下表：

表2.37个变异进一步评估结果表

研究总结

       本研究通过使用APC基因-ACMG/AMP变异分类标准，对APC基因变异进行重新分类，使得VUS变异大幅降低。其中，BS1、BA1证据的使用(人群频率阈值的变化)、BP4、BP7证据的使用是VUS变异降级为B/LB变异的主要原因。此外，功能丧失(LoF)是APC基因导致的家族性腺瘤性息肉病的主要致病机制，除位于APC基因β-连环蛋白结合域的个别错义变异评级为可能致病性外，其他APC基因错义变异均为B/LB或VUS变异。

相关文献和网址

1. https://www.lovd.nl/

2. https://cspec.genome.network/cspec/ui/svi/doc/GN089

3. Am J Hum Genet. 2024 Nov 7;111(11):2427-2443. [PMID: 39357517]