学术资源
一则由于深度内含子突变而导致的遗传性病例
患者基本信息
年龄：2岁
性别：男
Ⅲ-1先证者：双手拇指三指节，双脚各七脚趾，右侧胫骨较左侧短
家族史：
Ⅰ-2祖母：指一侧拇指三指节，一侧六指；
Ⅱ-2父亲：手拇指三指节，双脚各八脚趾；
Ⅱ-4姑姑：腿短，右脚四脚趾；
Ⅲ-2父母引产胎儿：双手拇指发育异常，双下肢小腿腓骨缺失，双足内翻，双足多趾畸形。
金诺诊断检测项目：OmniSeek®核心家系全外显子组检测
家系图
基因与疾病介绍
注释：肢体发育膜蛋白1基因 ( LMBR1) 的5号内含子区域包含一段高度保守的极化活性带调控序列 (ZRS) 。在发育的肢芽中，ZRS作为SSH分子的远程增强子，位于其下游1Mb处。
ZRS区域的致病性变异会破坏SSH主导的肢芽发育模式，导致一系列先天性肢体畸形，包括
①常染色体隐性遗传的无手足畸形（ACHP），其主要表型为双侧先天性的远端肢体缺失(肱骨远端缺失，胫骨骨干远端部分缺失，桡骨、尺骨、腓骨发育不全)和手脚发育不全(腕骨、掌骨、跗骨、跖骨和指骨发育不全)。；
②常染色体显性遗传的胫骨发育不全伴多指(趾)畸形（THYP）；其主要表型为先天性心脏缺陷，胫骨发育不全和多指(趾)畸性；
③Laurin－Sandrow综合征（LSS）；其特征为手脚多指(趾)畸形、鼻缺损(鼻翼发育不良、鼻小柱短)、髌骨缺失和腓骨重复等。
④轴前多指(趾)畸形II型（PPD2）；其主要表型为上肢内侧的多指趾畸形、拇指远端指骨重复、三指关节拇指和大脚趾的重复；
⑤并指(趾)IV型（SDTY4），特征是所有手指完全并指、多指，同时由于手指屈曲而伴有杯状手。
⑥拇指三指节畸形I型（TPT）：轴前多指、拇指远端指骨重复、三指关节拇指和大脚趾重复。
⑦同时该基因也与遗传模式不明的拇指三指节－多并趾综合症相关。
变异的致病性评估
LMBR1: c.4**+4919A>G：LP(PM2_Supporting+PS4_Supporting+PP1+PP4+PM1)
PM2_Supporting：GnomAD数据库、ExAC数据库、千人基因组数据库及本地数据库均未收录该变异。
PS4_Supporting：文献报道在两例先证者中检测到LMBR1基因变异c.4**+4919A>G [1]。
PP4：文献中受检者的临床表型符合LMBR1相关疾病的主要表型[1]。
PP1：文献报道在1个家系中检测到LMBR1基因变异c.4**+4919A>G与疾病表型共分离[1]。
a：F1家系图；
c：野生基因型（上）和受检者基因型（下）
PM1：该变异位于LMBR1基因的关键功能域ZRS区[2、3]。
NCBI收录信息
5C-Seq结果显示：Shh和ZRS互作在E11.5小鼠胚胎中显著富集
结论
根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）对基因变异临床意义的分类标准，本次基因检测在LMBR1基因中检出的变异c.4**+4919A>G为“可能致病性变异（LP）”。以上变异或可解释受检者“拇指三指节，七脚趾，右侧胫骨较左侧短”的临床表征。
受检者及其父母二代测序结果
受检者及其父母Sanger验证结果
目前的研究发现，部分基因的调控元件可位于邻近基因的结构中，比如本案例中SHH的调控序列ZRS就被纳入LMBR1基因的深度内含子区域[3]。此外，深度内含子突变所导致的假外显子激活也会基因功能异常[4]。
假外显子是前体mRNA内含子区域的潜在外显子，通常不会剪接成成熟的mRNA，若假外显子突变激活，产生可被识别的剪接供体或受体位点，导致内含子序列插入成熟的mRNA，假外显子的存在会导致翻译的过早停止[4]，已报道的相关基因包括DMD、COL4A5，BRCA2、GLA等。
最近在面向临床的筛选研究中引入了全基因组测序方法，使得越来越多的位于内含子深处的致病变异（即，距离外显子-内含子边界超过100个碱基对）被识别。而深度内含子与疾病的关系也得到了更多的关注[5]。
该机制目前也被应用于药物的研发，如branaplam通过与表达mHTT的mRNA前体结合，能够改变mRNA的剪接过程，在成熟mRNA中添加一个假外显子。这个添加的假外显子会触发mRNA的降解，从而降低突变和正常亨廷顿蛋白的产生。
参考文献
1.Norbnop P, Srichomthong C, Suphapeetiporn K, Shotelersuk V. ZRS 406A>G mutation in patients with tibial hypoplasia, polydactyly and triphalangeal first fingers. J Hum Genet. 2014 Aug;59(8):467-70. doi: 10.1038/jhg.2014.50.
2.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?Db=gene&Cmd=DetailsSearch&Term=105804841
3.Williamson I, Lettice LA, Hill RE, Bickmore WA. Shh and ZRS enhancer colocalisation is specific to the zone of polarising activity. Development. 2016 Aug 15;143(16):2994-3001. doi: 10.1242/dev.139188.
4.Romano M, Buratti E, Baralle D. Role of pseudoexons and pseudointrons in human cancer. Int J Cell Biol. 2013;2013:810572. doi:10.1155/2013/810572
5.Vaz-Drago R, Custódio N, Carmo-Fonseca M. Deep intronic mutations and human disease. Hum Genet. 2017;136(9):1093-1111. doi:10.1007/s00439-017-1809-4