一例SNV+外显子水平杂合缺失的肌营养不良病例

受检者基本信息

•受检者：男

•年龄：30岁

•主诉：双下肢肌萎缩2年余

•临床病史：患者于2+年前自觉双下肢无力，伴肌萎缩，无肌肉痛，无肌肉跳动，曾于***医院化验肌酶6752U/L，行肌电图检查提示"双胫前肌中等自发电位"，骨骼肌病理结果提示进行性肌营养不良，符合dysferlinopathy，提示肢带型肌营养不良2B型诊断。

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         根据肌肉活检提示肢带型肌营养不良2B型，受检者进一步进行了基因检测，选择***公司的肌肉病Panel检测项目。检测报告显示"未发现临床表型高度相关且致病性证据充分的基因变异"，即未发现可以解释受检者表型的变异。报告附录中提示的可疑变异包括ATP1A1基因变异c.3**5G>A、DYSF基因变异c.1**4G>T和ITGA7基因变异c.4**G>A。

           患者病情仍进行性加重，逐渐累及双下肢近端，蹲起及上下楼费力。再次求诊，门诊以"肌萎缩"收入院。入院主症：双下肢肌萎无力，远端为主，勾脚及踮脚费力，蹲起及上下楼费力。

          根据临床信息和检查结果，仍高度怀疑“肌营养不良？”故送检我司OmniSeek®全外显子组检测项目，想进一步排查是否有遗漏。

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分析结果及验证

          主要分析策略：根据受检者提供的临床信息，进行表型驱动分析。初步分析后，在SNV/Indel结果中发现受检者检出了其他公司附录报告的3个变异（见图1）。

图1.与受检者临床表型部分相关的变异

          其中，DYSF基因和ATGA7基因相关的疾病均为常染色体隐性遗传疾病，受检者均检出上述基因的一个杂合变异，无法解释表型。而ATP1A1基因虽然与常染色体显性遗传病相关，遗传模式相符，但ATP1A1基因变异c.3**5G>A的致病性证据不足，属于VUS-low，不能做为临床诊断的依据。

         由于临床高度怀疑“肌营养不良？”那是否DYSF基因或ATGA7基因存在另一个被遗漏的变异呢？

          根据人类孟德尔遗传学（OMIM）数据库中记载，ATGA7基因相关的ITGA7缺乏导致的先天性肌营养不良主要在婴儿期发病，与患者的发病年龄不符，故暂时排除。DYSF基因的致病性变异可导致肢带型肌营养不良2型（Muscular　dystrophy,　limb－girdle,　2,　LGMDR2）、Miyoshi肌营养不良1型（Miyoshi　muscular　dystrophy 　1,　MMD1）以及胫前起病远端型肌病（Myopathy,　distal,　with　anterior　tibial　onset,　DMAT）。上述疾病均呈常染色体隐性遗传模式，且通常在成年早期发病。

① Miyoshi肌营养不良1型

MMD1患者主要表现为远端肌无力和肌萎缩，且上肢和下肢同时受累，但保留了手部固有肌肉，脚尖站立受损，爬楼梯困难，行走困难，但通常仍可活动，血清肌酸激酶升高，肌肉活检显示肌病和营养不良的变化与坏死。

OMIM,https://www.omim.org/entry/254130

② 肢带型肌营养不良2型

LGMDR2（过去也被称为LGMD2B）患者的主要临床表型为近端肌无力，主要累及下肢，上肢受累较晚或根本没有受累，肌电图显示肌病改变，血清肌酸激酶升高，肌肉活检显示肌病和营养不良的变化与坏死。

OMIM,https://www.omim.org/entry/253601

③胫前起病远端型肌病

DMAT患者主要表现为肌肉活检显示肌病且无空泡，首先累及胫骨前肌，血清肌酸激酶升高。

OMIM,https://www.omim.org/entry/606768

          从发病年龄和表型角度考虑，DYSF基因的相关度较高。

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          另一方面，目前已发现的DYSF基因变异c.1**4G>T具有一定证据支持其致病性（包括人群频率罕见且REVEL功能预测软件结果偏向于致病）。因此，我们将后续深度挖掘的重点放在了DYSF基因上。

          惊喜的是，通过对WES分析数据中微缺失/微重复结果的深度分析，并使用IGV查看相关测序数据，我们发现DYSF基因第30号外显子信号降低，可能存在单个外显子缺失。若受检者同时检出DYSF基因变异c.1**4G>T和DYSF基因第30号外显子缺失，且上述变异为复合杂合变异，则符合疾病的遗传模式，或许可以解释受检者的临床表型。我们进一步通过qPCR验证证实了受检者DYSF基因第30号外显子存在杂合缺失。当然，可能会有同行质疑qPCR的准确性，严谨地说，后续还可以进一步通过WGS和/或Sanger测序找到30号外显子缺失的精确断点。

图2.WES的结果无法判断精确的断点位置，但是根据测序深度可以看到30号外显子存在缺失的可能性

图3.qPCR验证结果提示受检者DYSF基因第30号外显子存在缺失

结果解读

          评级证据（依据DYSF基因专项指南^[1]）：

a.PM2_Supporting：gnomAD数据库和本地数据库均未收录该变异。

b.PP3：REVEL功能预测软件结果偏向于致病性变异，预测值为0.82，预测结果仅供参考。

c.PP4：该受检者发病大于6个月且临床怀疑为LGMD，同时受检者还检出DYSF基因的另一变异。

          其他相关信息：

d.疾病数据库报道：ClinVar数据库报道该变异为意义不确定变异（1颗星）。

e.文献报道：已有文献报道在1例肌病患者中检测到该杂合变异，反式相位变异未明^[2]。

          我们同时检测到DYSF基因的exon30（NM_001130987.2）的缺失。DYSF基因总共有56个外显子，在没有探明具体的断点位置时（WES的方法局限性），预计仅导致30号外显子的缺失。30号外显子是个整码外显子，且占整个基因的比例<10%。后续我们深入查询相关文献及数据库后，并未发现这个外显子涉及明确重要的功能域。

          此外，人群多态性数据库DGV　Gold　Standard、人类基因组变异数据库ClinGen、疾病数据库Decipher等也都没有任何30号外显子缺失的记录。

结   论

          到此，本次基因检测在DYSF基因中检出的变异c.1**4G>T和第30号外显子杂合缺失均为“VUS”。这似乎并不能做为临床诊断的坚实证据，还有很多的工作需要去做。

思考与总结

          我们需要和临床一起找寻VUS升级的可能性。首先，受检者同时检出DYSF基因变异c.1**4G>T和DYSF基因第30号外显子杂合缺失，但是相位不明，建议受检者父母进一步验证以明确相位，这是坐实DYSF基因隐性遗传模式的首要任务。

          其次，还需要对这个病人做更详细的临床分析，最好是召集MDT会议，对这个病人已经做的各项检查包括肌电图，肌肉活检等结果结合基因检测结果进行深入分析，进行针对DYSF基因相关疾病的表型-基因型分析。

          最后，也给所有分子检测工作者一个警示，即当临床高度怀疑某种隐性遗传疾病，但WES仅检出其中一个杂合变异时，要进一步怀疑是否存在涉及该基因的其他变异，包括深度内含子变异、拷贝数变异、甚至是某些特殊区域的结构变异，特别是外显子水平的拷贝数缺失，这是WES的方法局限性，即便WGS也可能存在遗漏分析的风险。

参考文献

1. https://cspec.genome.network/cspec/ui/svi/doc/GN180

2. Acta Myol. 2013 Dec;32(3):148-53. [PMID:24803842]