MeltArray:高度多重实时定量荧光PCR分析方法

        MeltArray是一种高度多重实时定量荧光PCR的实验方法，可以单步、单管，不需要额外的酶或单独的反应就可以实现比目前实时定量荧光PCR检测的靶点多10倍以上。具有5‘-内切酶活性的DNA聚合酶将媒介探针水解成媒介引物，媒介引物与分子信标上的目标序列结合延伸使其发出对应的荧光信号，单个分子信标可以结合多个不同的媒介引物，从而产生一系列不同熔点的荧光杂交体；通过熔解曲线分析即可分辨不同靶点的荧光信号。

分子信标的选择

        通过线性分子信标与单链发夹结构分子信标对比发现：线性分子信标能与多余的媒介探针结合发出荧光基底信号，而单链发夹结构的分子信标与媒介探针结合不会发出干扰荧光信号，如图1。

图1  线性分子信标与单链发夹结构分子信标结果比对

HANDS机制

        通过在目标序列特异性引物的5’端添加20bp相同序列的标签，使得引物二聚体形成发夹结构，阻碍了通用引物的进入，阻止了引物-二聚体的扩增，并促进了具有高分析灵敏度的靶特异性扩增子的扩增，如图2。

图2 消除引物二聚体指数扩增机制

应用

        01.应用单个分子信标实现12重荧光PCR：

图3  单分子信标12-plex检测方法

        02.应用3种荧光6个分子信标实现人基因组Y染色体微缺失20重荧光PCR：

图4  20-plex人基因组Y染色体微缺失检测

        03.应用6种荧光实现E.coli O基因型61重分型及E.coli的yccT基因共62重荧光PCR:167株大肠杆菌分型结果与传统分型及WGS方法相比优于传统分型方法，略低于WGS分型：

图5  62-plex E.coli O基因分型鉴定

        04.应用4种荧光实现呼吸道病原体24重实时定量荧光PCR：

图6  24-plex呼吸道病原菌鉴定与定量检测

        05.应用4种荧光实现单管检测邻近3个SNP位点分型：

图7  SNP位点单管多重检测

实现方法

        MeltArray通过三方面实现单管、单步、高度多重荧光PCR：

        01.应用DNA聚合酶的5’-内切酶活性水解媒介探针形成媒介引物库；

        02.单个带有荧光的分子信标可以扩展多组媒介引物，以产生一系列具有不同熔化温度的荧光杂交体；

        03.所有目标序列特异引物的5’端都带有一段20bp与目标序列不匹配的相同的标签，这有利于引物-二聚体形成发夹结构，而不是相当长的靶特异性扩增子，发夹结构阻碍了通用引物的进入，阻止了引物-二聚体的扩增，并促进了具有高分析灵敏度的靶特异性扩增子的扩增。

参考文献:

Huang Q, Chen D, Du C, et al. Highly multiplex PCR assays by coupling the 5'-flap endonuclease activity of Taq DNA polymerase and molecular beacon reporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Mar 1;119(9):e2110672119. doi: 10.1073/pnas.2110672119. PMID: 35197282; PMCID: PMC8892341.
黄琦， 陈东， 杜春， 等.通过偶联 Taq DNA 聚合酶和分子信标报告基因的 5'-皮瓣核酸内切酶活性进行高度多重 PCR 检测。美国国家科学院院刊 2022 年 3 月 1 日;119（9）：e2110672119.doi： 10.1073/pnas.2110672119.PMID：35197282;PMCID：PMC8892341。