ClinGen SVI剪接小组的建议：基于 ACMG/AMP框架，剪接相关的预测性或观察性的证据的使用

简介

        ClinGen SVI剪接小组在本文中针对六个与剪接相关的证据类别：PVS1、PS3、PP3、BS3、BP4和BP7证据（以及PS1）在剪接变异分类中的使用提供了统一的建议。

PART 1

根据基序（motif）位置将剪接变异分为3类（图1）:

        剪接供体/受体±1,2二核苷酸变异

        位于内含子5‘或3’端2个碱基区域内。

        剪接区变异

        发生在供体基序或受体基序内。

        最小剪接区变异

        发生在上述供体基序，或最小高度保守的受体基序内。

图1

        Pre-mRNA的剪接主要依赖于以下顺式作用的调控元件：1.剪接供体；2.剪接受体；3.剪接受体上游的多聚嘧啶序列和分支位点(通常位于-18 ~ -44位置)。
        绝大多数内含子(＞98%)5'端是GT，3'端是AG，是高度保守的二核苷酸，由U2剪接体(spliceosome)识别。

        Burge等(1999)定义了供体/受体基序的边界——供体剪接位点基序：外显子最后面的3个碱基~内含子前8个碱基；受体剪接位点基序：内含子最后面的12碱基~外显子的前2个碱基。
        剪接小组对U2型内含子的位置权重矩阵图进行分析，发现这些基序中某些位置有简并性——位于供体基序和受体基序的变异最有可能对剪接产生影响。二次分析后，剪接小组定义了一个最小剪接区域，和上述供体基序一致，但受体剪接区域则缩小为外显子的第1个碱基和外显子边界上游的3个碱基。

PART 2

针对剪接供体/受体±1,2二核苷酸变异的基因特异性PVS1决策树（例举说明）（图 2）：

图2

        A.PVS1_N/A

            5'UTR区域：没有剪接改变预测或使用隐匿剪接基序不影响编码序列。

        B.PVS1

            外显子跳跃或使用隐匿剪接基序破坏了起始密码子，并且没有可替代的起始密码子。

        C.PVS1

            外显子跳跃或使用隐匿剪接基序破坏阅读框，并预计会发生NMD。

        D.PVS1_S

            外显子跳跃或使用隐匿剪接基序保留了阅读框，但丢失了一段蛋白质序列(>10%)，该序列未被证实为蛋白关键功能域。

        E.PVS1

            外显子跳跃或使用隐匿剪接基序会破坏阅读框，并预计会发生NMD。

        F.PVS1

            外显子跳跃或使用隐匿剪接基序保留了阅读框，并丢失了一个已确定的蛋白关键功能域。

        G.PVS1_M

            外显子跳跃或使用隐匿剪接基序保留阅读框，但丢失了一段蛋白质序列(＜10%)，该序列未被证实为蛋白关键功能域。

        H.IPVS1_M

            外显子跳跃或使用隐匿剪接基序会破坏阅读框，预计不会发生NMD，丢失了一段蛋白质序列(＜10%)，该序列未被证实为蛋白关键功能域。

        注意：如果一个基因既可通过LoF（Loss of Function）又可通过GoF（Gain of Function）机制致病，而该基因符合PVS1条件的变异预计导致GoF，剪接小组建议使用PM4。

PART 3  

PVS1/BP7与体外剪接检测数据

        对于剪接供体/受体±1,2 二核苷酸变异，当预测结果与体外剪接检测结果不同时，应考虑根据剪接检测结果适当调整PVS1强度；

        对于剪接供体/受体 ±1,2 二核苷酸之外的变异。如果体外剪接检测结果提示变异导致异常剪接，也可根据PVS1决策树使用PVS1。

        如果PVS1的应用不仅是由于预测结果，还使用了剪接检测数据，建议添加额外注释，如PVS1_Strength（RNA），或注明PVS1的应用是由于剪接检测数据的存在。

        建议PS3/BS3仅用于评估功能影响实验。体外剪接检测证实同义变异和内含子变异对剪接没有影响的情况，建议使用BP7_Strong（RNA），或说明BP7_Strong的应用是由于剪接检测数据的支持。

PART 4  

根据样本类型、检测技术和转录本复杂性调整证据强度

        保守建议PVS1和BP7证据仅适用于非肿瘤组织样本进行的剪接检测结果；

        在没有临床数据对实验系统进行校准的情况下，对基于质粒构建的检测技术，如minigene、 MPRA等，建议仅使用较低强度；

        对于不完全剪接变异（''leaky''）：减少但不完全破坏参考转录本正常剪接的变异，需要确定异常转录本在特定基因-疾病关系中的致病比例。

PART 5

PP3/BP4与剪接预测结果:

        对比11种剪接预测工具，剪接小组最终选取SpliceAI展示了测定剪接预测工具阈值的模型（图3）。

图3

        最终确定了供体/受体±1,2二核苷酸之外的变异使用PP3的最佳阈值为≥0.2，这一阈值灵敏度约78%。使用BP4的最佳阈值为≤0.1，特异性为87%（图4）。

图4

        对位于供体/受体±1,2二核苷酸位置以外的变异（图5），

        ▲SpliceAI评分≤0.1，可使用BP4证据；如果是同义变异或内含子变异(位于供体/受体外)；可进一步使用BP7证据。

        ▲ SpliceAI评分为≥0.2，预测会发生剪接，使用PP3证据；

        ▲ SpliceAI评分在0.1~0.2之间，考虑为错义变异或Indel。

图5

PART 6

BP7的应用:

        同义变异，且剪接预测既不会影响剪接，也不会产生新的剪接位点，同时该核苷酸的保守性不高。

        1.建议BP7不应用于位于外显子第1个碱基或最后3个碱基的同义替换。

        2.建议不要将进化保守性纳入考虑。

        3.剪接小组认为可将BP7的应用范围扩大到位于最小剪接区之外的内含子变异。

PART 7  

PS1/PM5与剪接预测结果

        PM5不适合直接用于剪接变异。

        PS1的适用情况需考虑：待分类变异和已知（可能）致病变异位于剪接供体/受体±1,2二核苷酸之外或之内以及两者的相对位置（图6）。

        注意：PS1的使用前提是，待分类变异的生信预测分数≥已知致病变异的生信预测分数。

图6

PART 8  

获取与变异位置、剪接预测、剪接检测数据和变异类型有关的证据

        剪接小组提供了基于变异位置、生信预测、剪接检测和已知致病变异确定适用证据的决策树（图7）。

图7

总结

1.PVS1

        已知LoF致病机制的基因中的无效变异（如无义、移码、±1或2剪接位点、起始密码子、单个或多外显子缺失）；

        更新后建议：仅有生信预测结果，已确定LOF为致病机制的经典剪接位点（±1,2)变异；对于剪接检测实验证明异常剪接的，应使用PVS1_Strength （RNA）。

2.PS1

        与先前已确定的致病变异有相同的氨基酸改变；

        更新后建议：变异预测的剪接效应与先前（可能）致病变异相同。

3.PS3

        体外或体内功能研究支持变异对基因或基因产物具有破坏性作用；

        更新后建议：不适用于体外剪接实验。

4.PP3

        多种计算机软件预测显示变异对基因或基因产物产生有害影响（保守、进化、剪接影响等）；

        更新后建议：不需要多种工具，但建议对预测工具进行校准；当没有剪接实验数据时，仅用于非典型剪接位点变异；对于外显子变异，还应考虑变异对蛋白功能的影响。

5.BS3

        体外或体内功能研究不支持变异对基因或基因产物具有破坏性作用；

        更新后建议：不适用于体外剪接实验数据。

6.BP4

        多种计算机软件预测变异不会对基因或基因产物产生有害影响（保守、进化、剪接影响等）；

        更新后建议：不需要多个工具，但建议对预测工具进行校准；选择恰当的剪接预测的阈值；对于外显子变异，还应考虑变异对蛋白功能的影响。

7.BP7

        同义变异，其剪接预测不会对剪接标准序列产生影响，也不会产生新的剪接位点，而且它的核苷酸不高度保守；

        更新后建议：只有满足BP4时才适用；不考虑变异位点的进化保守性；仅适用于指定剪接区域外的内含子/非编码变异（+7/-21之外的内含子变异或不位于外显子第1和最后3个碱基之外的同义外显子变异）；剪接实验数据表明，变异不会引起异常剪接效应。适用BP7_Strong （RNA），不用BS3；对于外显子变异，还应考虑变异对蛋白功能的影响。

汇总图