在产前检测中发现的DMD重复变异需谨慎解释

       杜氏肌营养不良( Duchenne muscular dystrophy , DMD ) 是一种X连锁隐性遗传病。DMD的发病率约为1/5000，患者多为男性，病情进展快速，通常在儿童期早期发病，主要临床表征包括肌肉进行性萎缩无力、腓肠肌假性肥大等。DMD是由位于Xp21.2区DMD基因突变所致，DMD基因全长约2.3Mb，共包含79个外显子，DMD基因的变异以外显子缺失/重复为主。

表1. DMD基因的变异类型占比^[1]

       2022年中信湘雅生殖与遗传专科医院杜娟研究团队在《Genes》杂志上发表了”Reclassification of DMD Duplications as Benign:Recommendations for Cautious Interpretation of VariantsIdentified in Prenatal Screening“一文^[2]，报道了一例在产前检测中通过家系分析将已归类为致病性的DMD重复重新分类为良性的病例。

一、先证者

l 30岁女性（II-1）

l 被诊断为由染色体17p12微缺失（包括PMP22基因）引起的遗传性压力易感性周围神经病（HNPP）

l 先证者29岁怀孕，在当地医院进行无创产前筛查（NIPS），发现其男性胎儿17p12染色体缺失1.42Mb（III-1），后用染色体微阵列分析证实了17p12的微缺失。与此同时，在羊水细胞中额外发现了两个重复的Xp21片段（分别包含DMD基因51-53号外显子和64-79号外显子），其中DMD基因64-79外显子重复在LOVD数据库中被记录为致病变异，但是该家庭中没有任何成员被诊断为DMD/BMD。在当地医院进行遗传咨询后，考虑到男性胎儿具有患肌营养不良症的可能性，这对夫妇选择了终止妊娠。

       胎儿父母来到中信湘雅生殖与遗传专科医院进行辅助生殖和遗传咨询。在采集了先证者（II-1）、先证者父母及其丈夫的外周血后，采用MLPA、qPCR、Sanger、OGM等技术进行了遗传学检测。

二、结果

       ①MLPA和qPCR分析

       在先证者样本中也发现了和胎儿相同的2个不连续的DMD重复（但拷贝数均为四个拷贝），经其父亲的样本检测后，结果提示这些重复是遗传自其父亲（I-1）（外显子51-53和64-79各三个拷贝），先证者母亲（I-2）的DMD基因拷贝数正常（图1）。先证者父亲未出现肌无力、肌萎缩、腓肠肌假性肥大等DMD/BMD相关症状，血清肌酸激酶及肌酸激酶同工酶亦在正常浓度。

       此外，qPCR结果显示先证者（II-1）和其父亲（I-1）携带两个PMP22缺失（包括外显子1-5和外显子4-5），其母亲（I-2）的PMP22基因拷贝数正常(图1)。

图1. 一个具有DMD重复和PMP22缺失的中国家庭的家系图

黑色实心符号代表PMP22缺失的个体；灰色填充符号代表具有DMD重复的个体。半黑半灰符号代表杂合PMP22和DMD突变携带者。

       ②OGM和Sanger测序结果

       鉴于先证者父亲（I-1）的肌酸激酶及其同工酶水平正常，研究者对该家族中非连续的DMD重复（外显子51-53和64-79）的致病性产生了疑问。

       为了进一步验证，后利用光学基因组图谱技术（OGM）确定了先证者父亲（I-1）的DMD基因的复杂结构变异。首先，在先证者（II-1）和她的父亲（I-1）样本中，OGM除了DMD外显子51-53和外显子64-79重复外，还发现了第三段重复，即内含子55重复。父亲（I-1）携带DMD外显子51-53、64-79各三个拷贝和内含子55两个拷贝，先证者从父亲那里遗传了相同的变异。更重要的是，OGM结果显示其父亲（I-1）携带一个完整的DMD基因和另一个独立的DMD基因复杂结构重排，后者由DMD重复的区域构成（图2a）。

图2. OGM的检测结果和DMD基因的断点分析

（a）OGM结果。完整的DMD基因以红色边框标记，DMD基因重组区以黄色边框标记。橙色、黑色和绿色线条之间的区域分别代表DMD基因外显子79-64、内含子55和外显子53-51的重复；（b）DMD基因的重排模式和断裂点结构。

       ③总结

       经检测该先证者具有PMP22基因杂合缺失和DMD基因的三个非连续性重复，其中PMP22基因缺失已被报道为致病性变异，该缺失可以解释先证者所患的遗传性压力易感性周围神经病（HNPP）。在经过OGM检测以及家系分析后发现，该家族中所检测到的DMD基因重复区域尽管发生了复杂的重排，但并未破坏原本DMD基因的完整结构，这三段重复在这个病例中倾向于良性变异，导致肌营养不良症的可能性较小。

三、对DMD重复变异进行断点分析的重要性

       OGM技术可以分析拷贝数重复区域所发生的具体位置及方向。已有研究结果^[3]表明，染色体上发生的重复（duplication）大部分为原位串联重复（tandem in direct orientation），但少数可能发生其他位置的插入而导致基因融合，这可能是重复携带者的临床异质性较高的原因之一。

       因此，作者建议对DMD重复变异进行断点分析，并谨慎解释产前检测中发现的DMD重复的致病性。试想一下，对于本次检测的DMD重复，如果发生的是串联重复，则可能破坏DMD基因的结构，后果是否就不一样了呢？

项目介绍

       光学基因组图谱技术（optical genome mapping，OGM）

       一种新型超长单分子检测技术，其对DNA分子上特异性的识别序列CTTAAG进行标记，随后通过芯片上的特殊结构将DNA分子线性化，在电泳的作用下通过纳米通道并拍照，从而实现超长单链的高分辨率荧光成像。因OGM全程无需PCR扩增，故无基因组偏好性，亦不受GC含量影响。OGM的分辨率可以达到500bp，可以检测到包括非整倍体、缺失、重复、倒位、易位等多种染色体变异，且多个研究证明，与其他遗传学分析技术相比，OGM显示了结果的高效性与一致性。

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       金诺诊断最新推出的下一代细胞遗传学诊断产品。该产品应用Bionano光学基因组图谱分析技术（Optical Genomic Mapping, OGM）全面检测各种结构变异，包括平衡易位、倒位、缺失/重复、插入等，可广泛应用于不孕不育、儿童遗传病/罕见病、肿瘤等疾病的遗传病因诊断。

参考文献

1.Tuffery‐Giraud S, Béroud C, Leturcq F, et al. Genotype–phenotype analysis in 2,405 patients with a dystrophinopathy using the UMD–DMD database: a model of nationwide knowledgebase[J]. Human mutation, 2009, 30(6): 934-945.

2. He W, Meng G, Hu X, et al. Reclassification of DMD Duplications as Benign: Recommendations for Cautious Interpretation of Variants Identified in Prenatal Screening[J]. Genes, 2022, 13(11): 1972.

3. Newman, S., et al., Next-generation sequencing of duplication CNVs reveals that most are tandem and some create fusion genes at breakpoints. Am J Hum Genet, 2015. 96(2): p. 208-20.